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RELATIONSHIP OF PDGFA AND B EXPRESSION LEVELS AND NEOVASCULARIZATION LYMPHATIC OF CERVICAL SQUAMOUS CELL CARCINOMA
ZHAO Lina, LIU Guocheng
【摘 要】目的
研究血小板源性生长因子家族(Platelete-Derived Growth Factor A、B)在早期宫颈鳞癌组织中的表达,探讨PDGF-A、B与早期宫颈鳞癌组织中微血管密度(Blood Vessels Density, BVD)和微淋巴管密度(Lymphatic Vessels Density, LVD)关系及其临床意义.方法采用RT-PCR及Real-time RT-PCR法检测45例宫颈鳞癌组织(研究组)中PDGF-A、B在mRNA水平的表达；以CD34和D2-40单克隆抗体检测宫颈鳞癌组织中的BVD和LVD水平,同时选45例正常宫颈组织作对照,分析PDGF-A、B表达与肿瘤分级、分期及转移、预后的关系.结果PDGF-A、B在早期宫颈鳞癌组织中的mRNA表达水平均显著高于对照组（p<,0.05）,PDGF-A、B表达水平与BVD和LVD呈正相关关系（p<,0.01,r等于0.49,0.527,0.327,0.68）, 早期宫颈鳞癌中BVD和LVD的密度显著高于对照组（p<,0.001）,癌周组织中BVD和LVD的密度显著高于癌中心组织,LVD的密度与肿瘤淋巴结转移有关（p<,0.001）,BVD和LVD水平与肿瘤细胞分化、病理分级、分期无关.结论PDGF-A、B在早期宫颈癌中的表达水平与肿瘤临床分期,肿瘤淋巴转移及预后密切相关.
【关键词】宫颈癌血管新生淋巴管新生血小板源性生长因子
doi:10.3969/j.issn.1671-332X.2013.01.005
肿瘤淋巴转移机理与肿瘤新生淋巴管（淋巴管新生）研究成为继血管生成机理研究的前沿领域,新的淋巴管特异性标记物的发现为深入淋巴管机理的研究提供了可能.研究表明,许多肿瘤可能存在新生淋巴管,通过用淋巴管内皮细胞表面标记证实在肿瘤周围存在着淋巴管新生和淋巴管扩张的现象,肿瘤具有使其周围淋巴管数目增加的特性,导致其转移的可能性增加［1］.据报道,PDGF-A和PDGF-B在宫颈癌组织中有高表达,并发现PDGF-AA可以调节Nicotine诱导的癌变［2］.最近发现,PDGF-A、B受体在宫颈癌组织中有表达,认为是潜在的抑癌位点,且PDGF-A、B都能促进淋巴管的新生［3］.本实验以单克隆抗体D2-40和CD34两种免疫组化方法,对早期宫颈癌同一组织进行微淋巴管与微血管的染色,旨在观察微淋巴管和微血管的分布特点,探讨其与淋巴结转移及预后的关系,同时定量检测宫颈组织中的PDGF-A、B的表达水平.
1.材料与方法
1.1一般资料
选取45例2009~2012年我院行广泛子宫全切+盆腔淋巴结清扫术宫颈癌病例,高、中、低分化鳞癌各15例,浸润癌36例,其中有盆腔淋巴转移者10例,无盆腔淋巴转移者26例,原位癌9例；要求包括癌中心组织、癌边缘区组织和相应周围大致正常组织,癌边缘区组织距肿物边缘0.3 cm以内,周围大致正常组织距肿物边缘≥5.0 cm.对照组新鲜组织来自临床钳取活检或手术切除,液氮储存后分批集中用于试验.所有病例术前均未接受放化疗并在术后得到病理科的证实,患者年龄24～78岁,平均44.8岁.
1.2免疫组织化学染色
联合运用两种免疫组化染色抗体D2-40（M2A）和CD34进行染色.淋巴管特异标记D2-40对45例宫颈癌组织、癌边缘区组织及其相应正常组织进行免疫组织化学染色检测微淋巴管密度,以CD34标记微血管作为对比.常规石蜡切片共4张,一张为HE常规染色,两张分别以D2-40和CD34为一抗标记微淋巴染色管和微血管,一张以PBS代替抗体作为阴性对照,抗体的工作浓度：CD34为1：100,D2-40为1∶400.同法检测对照组.D2-40和CD34抗体免疫组织化学染色方法按两步法步骤进行,经DAB显色后,苏木素复染,中性树胶封片,PBS代替一抗作阴性对照
1.3RT-PCR
以β-肌动蛋白（β-actin）为内参,其引物序列上游5′ - TCACCCACACTGTGCCCATCYCTACGA-3′下游引物序列为5′ - CAGCGGAACCGCTCA论文范文GCCAATGG- 3′；PDGF-A的上游引物序列为：5′-AAGAACTATGCGTCAACCAATCG- 3′下游引物序列为：5′ -CAGGGCACACCAACAACACAG-3′；PDGF-B的上游引物序列为：5′-论文范文GAGGTGGTGTAGATGGT-3′下游引物序列为：5′-GGAGGTAGAGAGATGAAAGG-3′；所有引物为自行用primer 5.0设计NCBI核对后由Invitrogen公司合成,引物工作浓度10 Pmol/L.PCR反应扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶上3 V/cm恒压电泳40 min,紫外荧光灯下观察结果.Real-time RT-PCR 实时荧光定量 PCR用 ABI GeneAmp 5700荧光定量 PCR仪进行反应并检测,反应试剂为SYBR Green Real-time PCR Master Mix.反应条件: 预变性95 ℃ 1min, 95 ℃变性15 s,60 ℃退火15 s,72 ℃延伸45 s,共40个循环.
1.4结果判定
D2-40和CD34阳性的判定以细胞质染色有清晰淡论文范文至棕论文范文颗粒为准.本组将D2-40+/CD34-管腔视为微淋巴管,将CD34+管腔视为微血管.管腔的判定标准：棕论文范文细长管壁包绕的条索状或塌陷状不规则形的管腔,内无红细胞,由大且向腔内突出的单层内皮细胞构成,凡血管腔直径大于8个红细胞或管壁带有明显的肌层以及纤维硬化,炎症及坏死的微血管（或微淋巴管）均不计入总数,计数微血管（微淋巴管）时,先采用低倍物镜(×10) 观察, 寻找微血管（或微淋巴管）最多的区域, 然后用高倍物镜(×40),计数3 个视野, 求其均值.
1.5统计方法采用t检验,统计学处理采用 SPSS 11.0统计分析软件.
2.结果
2.145例宫颈癌组织中PDGF-A、B的表达
荧光定量PCR检测结果,PDGF-A、B在各期宫颈癌症组织中的表达水平均明显高于对照组（PDGF-A（2.67±1.79） VS （1.14±1.002）, p<,0.01； PDGF-B （2.27±1.69） VS （0.80±0.52）,p<,0.01）.见图1.
2.2宫颈癌组织中微血管密度（BVD）和微淋巴管密度（LVD）
研究组BVD密度显著高于对照组,BVD随着宫颈癌期别的进展而显著增加（p<,0.001）,与淋巴结转移、肿瘤细胞的分化、组织学类型无相关性.D2-40相关免疫组织化学染色可见,研究组癌灶周边及癌灶中心LVD密度均显著高于对照组,癌灶周边LVD密度显著高于癌灶中心密度,LVD与盆腔淋巴结转移密切相关,与细胞分化程度和组织学类型无显著关联.见图2.
图1PDGF-A、B在宫颈癌症组织中的表达
注：RT-PCR 分析PDGF论文范文RNA在宫颈组织中的表达,可见四种PDGF家族成员在宫颈癌组织中mRNA水平均高于正常宫颈组织（1和2）和宫颈原位癌组织(3~5).Real-time PCR 分析显示, PDGF-A,B在早期宫颈鳞癌组中的mRNA表达显著高于对照组.
图2宫颈组织的微血管和微淋巴管
注：A和B显示宫颈癌组织中的微淋巴管,A为IIa期病例,可见大量的微血管(×400),B为Ia1期病例,在早期基底膜下的癌灶论文范文可见数个新生的微血管(×400).C和D分别是正常宫颈和早期鳞癌组织中的微淋巴管分布,C为正常宫颈组织,基底膜下的微淋巴管数目不多且大多处于闭合状态(×200),D为鳞癌组织中的微淋巴管,可见癌灶周围有一圈不见管腔结构的D2-40阳性反应带,附件有数个开放的淋巴管分布(×100).
2.3宫颈癌组织中的PDGFs的mRNA表达与BVD及LVD形成的关系
结果显示,PDGF-A、B表达水平与BVD和LVD呈正相关关系（p<,0.01,r等于0.59,0.42,0.32,0.58）,PDGF-B与LVD（r等于0.78,p<,0.05）的相关性强于其对BVD（r等于0.27,p<,0.05）的相关性.
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3.讨论
1974年ROSS等人发现凝血块或全血中存在有促进间充质细胞(如成纤维细胞等)分裂作用的物质,被命名为血小板源性生长因子［4］.研究发现,除血小板外,单核巨噬细胞、血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、胎盘和胚胎细胞、系膜细胞及一些转化的细胞等均可产生和释放PDGF.PDGF是含有糖链分子量为30KD左右的多肽生长因子,至少具有4个基因产物(PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D)的二聚体家族,包括同型二聚体(PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-CC、PDGF-DD)及异型二聚体(PDGF-AB).人PDGF-A和PDGF-B基因分别位于7号和22号染色体,DNA长分别约22~24 Kb和24 Kb,均由7个外显子.PDGF通过作用于细胞膜上的专一受体产生一系列的生物学效应［5］.PDGF的受体是由两个亚单位(α,β) 组成的 酪 氨 酸 激 酶 复 合 体( PDGFRαα、αβ、ββ).配体与受体的结合具有相对特异性, PDGF-A只可特异性地激活PDGFR-αα, PDGF-B则可激活任何一种PFGFR.PDGF参与体内多种生理和病理调节过程,PDGF及其受体的过表达与恶性实体肿瘤密切相关［6］.
动物实验表明,PDGF能刺激多种细胞如血管平滑肌细胞、成纤维细胞、胶原细胞的分裂增生,通过刺激胶原合成和胶原酶的活化作用调节胞外基质的更新,最终导致DNA合成和细胞裂解、增殖［7］.本研究显示,PDGF-A、B mRNA在各期宫颈癌组织中的表达水平均明显高于对照组,提示PDGF-A、B的高表达,与其特异性受体结合可促进宫颈癌细胞的增殖,分化,加剧病情恶化.临床研究证实,肿瘤周围存在着淋巴管新生和淋巴管扩张的现象,肿瘤具有使其周围淋巴管数目增加的特性,导致其转移的可能性增加［8］.本资料表明,研究组BVD密度显著高于对照组,BVD随着宫颈癌期别的进展而显著增加（p<,0.001）,与淋巴结转移、肿瘤细胞的分化、组织学类型无相关性.D2-40相关免疫组织化学染色可见,研究组癌灶周边及癌灶中心LVD密度均显著高于对照组,癌灶周边LVD密度显著高于癌灶中心密度, LVD与盆腔淋巴结转移密切相关,与细胞分化程度和组织学类型无显著关联.
参考文献
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总结：本文关于淋巴管组织论文范文,可以做为相关论文参考文献,与写作提纲思路参考。
淋巴管囊肿引用文献:
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